واحد علوم پايه

 

پرسنل

 

علي دهقاني فيروزآبادي

پژوهشگر

 ali.dehghani.molmed@gmail.com

ü      dehghani@ssu.ac.ir

 

 

 بهنام ابراهيمي

bhnmebrahimi@yahoo.com

https://scholar.google.com/citations?user=nys1Eq0AAAAJ&hl=en

 

************************************************************************************

واحد مطالعات سلولي و مولكولي

مقدمه و معرفي

نوع بشر همواره در گذر تاريخ با بيماري­هاي مختلف روبرو بوده است. بسياري از بيماري­هايي كه امروزه خيلي ساده درمان مي­شوند در گذشته عامل مرگ و مير بسيار بوده اند. پس از كشف واكسن آبله توسط ادوارد جنر يا با كشف آنتي­بيوتيك پني­سيلين توسط الكساندر فلمينگ بسياري از انسانها از بيماري­هاي عفوني جان سالم بدر مي­برند. امروزه نيز مشكلات و بيماري­هايي وجود دارند كه هنوز  درمان قطعي ندارند و دانشمندان در سرار جهان به دنبال درمان اين بيماري­ها مي­باشند، از جمله پاركينسون، آلزايمر، صرع، ضايعات نخاعي، ديابت، بيماري­هاي پوستي و سوختگي­ها، مشكلات مفاصل و استخوان و سكته قلبي كه منجر به مردن بافت عضله قلب و درنهايت مرگ افراد مي­شود. يكي از گزينه­هايي كه امروزه براي درمان اين بيماري­ها مورد توجه خاص جوامع علمي جهاني قرار گرفته است استفاده از سلول­هاي بنيادي است. به دليل تنوع پذيري و توانائي تمايزهاي مختلفي كه سلولهاي بنيادي دارند دانشمندان علوم مختلف سعي مي­كنند استفاده خود را از اين سلول­ها ببرند يا از اين سلول­ها در زمينه علمي و پژوهشي خود استفاده كنند. بعنوان مثال در دانشگاه­هاي كشور خودمان شاهد اين هستيم كه در بيشتر مراكز تحقيقاتي علوم  اعصاب، پوست و بيماري­هاي پوستي، ديابت، كبد و بيماري­هاي كبدي و همچنين قلب و عروق آزمايشگاه­هاي سلول­هاي بنيادي راه اندازي شده است و همه اين آزمايشگاهها سعي مي­كنند از اين تكنولوژي نوظهور در جهت اهداف خود استفاده كنند. آزمايشگاه بيولوژي مولكولي و سلول­هاي بنيادي مركز تحقيقات قلب و عروق يزد با هدف پژوهش در زمينه­هاي جداسازي و كشت انواع سلول­هاي بنيادي مزانشيمي و پرتوان القائي و  تبديل و تمايز آنها به سلول­هاي عضله قلب (كارديوميوسيت)، ايمونولوژي و كارديولوژي مولكولي سكته قلبي (Myocardial Infarction) و نارسائي قلبي با استفاده از مدل­هاي حيواني ايسكمي حاد و مزمن قلبي، استفاده از سلولهاي بنيادي در اين مدل­ها و بازسازي (Regeneration) عضله مرده قلب فعاليت مي­كند. 

 

 

معرفي سلولهاي بنيادي

ويژگي عمومي سلول بنيادي:

طبق تعريف سلول بنيادي Stem Cell به سلول تمايز نيافته­اي اطلاق مي­شود كه حداقل دو ويژگي زير را در سطح يك سلول دارا باشد (شكل 1-1)[Verfaillie et al., 2002]:

1. توانايي تقسيمات مكرّر خودبازسازي Self-Renewal: سلول بنيادي با هر تقسيم ساده ميتوزي دو سلول دختر بوجود مي­ آورد. يكي از اين سلول­ها همانند سلول مادري اين توانايي (تقسيمات مكرّر خودبازسازي) را در خود حفظ مي­كند و همچنان به تقسيم ادامه مي­دهد، ولي سلول ديگر از چرخه ­ي تقسيمات پي­درپي خارج شده و وارد مسير تمايزي مي­شود. مكانيسم يا مكانيسم­ هايي كه تعيين مي­كنند كدام سلول دختري همچنان ويژگي بنيادي بودن را حفظ كند و كدام يك وارد مسير تمايزي شود چندان شناخته شده نيست. اما برخي عوامل كه در سلول مادري حضور دارند و در تعيين سرنوشت سلول مؤثر هستند ممكن است تنها وارد يك سلول شده و سرنوشت آن­را تغيير دهند. عوامل محيطي كه از خارج بر سلول اثر دارند نيز مي­توانند سرنوشت آن­را عوض كنند [Raff., 2003].

 

2. قدرت تمايز به بيش­از يك نوع سلول: آن سلول دختري كه وارد مسير تمايز مي­شود توانايي آن­را دارد كه به چند سلول مختلف تمايز يابد. مثلا سلول بنيادي خون ­ساز انواع سلول­هاي خوني اعم از رده­ ي لمفوئيد و ميلوئيد را مي­سازد. سلول بنيادي عصبي به سلول­هاي نوروني، آستروسيت و اليگودندروسيت و سلول بنيادي مزانشيمي به سلول­هاي اوستئوبلاست، كندروبلاست و آديپوسيت تمايز مي­يابند [Verfaillie et al., 2002].

 

سلول بنيادي در مسير تمايز ابتدا به سلول پيش ساز Precursor تبديل مي­شود. سلول پيش ساز هنوز قدرت تمايز را از دست نداده است و قبل از تمايز كامل مي­تواند با چندبار تقسيم تعداد سلول­هاي تمايز نيافته را افزايش دهد. در حقيقت مرز چندان مشخصي بين سلول بنيادي با سلول پيش ساز وجود ندارد و بايد گفت اين­ها اصطلاحاتي است كه از طرف پژوهشگران به صورت نه چندان شفاف بكار مي­رود. (البته بعضي تفاوت­ها در سطح مولكولي به اين نوع طبقه بندي نيز كمك مي­كند. مثلا در اغلب سلول­هاي بنيادي انسان فعاليّت تلومراز ديده مي­شود، اما در بيشتر سلول­هاي پيش ساز انساني آنزيم تلومراز خاموش است [Raff., 2003].

سلول­هاي بنيادي را بر حسب ميزان پتانسيل تمايزي ­شان در چند سطح طبقه­بندي مي­كنند [Wagers et al., 2004]: 

 

·         همه ­توان Totipotent سلولي است كه مي­تواند به تمام انواع سلول­هاي روياني و خارج روياني تمايز يابد. بعضي از سلول­هاي گياهي (حتي سلول­هاي تمايز يافته گياه) از اين نوع مي­باشند، چرا كه از يك سلول مي­توان يك گياه كامل بدست آورد.

·         پر­توان Pluripotent سلولي است كه مي­تواند به تمام انواع سلول­هاي سه لايه روياني اكتودرم، مزودرم و اندودرم تمايز يابد. سلول­هاي بنيادي روياني Embryonic Stem Cells (ESCs) از اين نوع مي­باشند.

·         چندتوان Multipotent سلولي است كه مي­تواند به مجموعه­اي از چند رده سلولي تمايز يابد. بيشتر سلول­هاي بنيادي بزرگسال Adult Stem Cells از اين نوع هستند.

·         محدودتوان Oligopotent سلولي است كه مي­تواند به تعداد محدودي از چند رده سلولي تمايز يابد در حقيقت پتانسيل تمايزي اين سلول از سلول چندتوان كمتر است.

·         تك­توان Unipotent اين نوع سلول بنيادي تنها مي­تواند به يك نوع سلول تمايز يابد.

انواع سلول بنيادي

سلول­هاي بنيادي را بر حسب منبع بدست آوردن آن­ها به دو دسته كلي تقسيم­ بندي مي­كنند:

سلول بنيادي روياني

از توده سلولي داخلي مرحله بلاستوسيست رويان بدست مي­آيند. اين سلول­ها توانايي تقسيم نامحدود و تمايز به سلول­هايي از هر سه لايه روياني را بطور in vitro  و همچنين in vivo دارا هستند و لذا جزء سلول­هاي بيش­توان به شمار مي­آيند. سلول­هاي بنيادي موش در اوايل دهه 1980 ميلادي [Evans et al., 1981] و سلول­هاي بنيادي انسان اولين­بار در سال 1998 جداسازي شدند [Thomson et al., 1998]. سلول­هاي بنيادي روياني با داشتن پتانسيل بيش­تواني  ارزش و كاربرد زيادي  در مطالعه رشد و تكوين انسان در دوران روياني، كشف داروهاي جديد و بررسي اثرات آن­ها و ترميم بافت­هاي آسيب ديده دارند [Conley et al., 2004]. امّا عليرغم اين ويژگي ­هاي مفيد، داراي مشكلات و نقاط ضعفي نيز مي­باشند:

·         تهيه سلول­هاي بنيادي روياني كار دشواري است و مستلزم انجام لقاح آزمايشگاهي و كشت رويان تا حدود روز پنجم (در انسان) است تا رويان به مرحله بلاستوسيست برسد. آنگاه بايد سلول­هاي توده سلولي داخلي را برداشته و روي سلول­هايي مانند فيبروبلاست جنين موش كشت داد. اين در حالي است كه تهيه سلول­هاي بنيادي بزرگسال به نسبت راحت­تر است و اغلب نيازي به سلول­هاي لايه مغذي Feeder Layer ندارند.

·         اگر اين سلول­ها به قصد ترميم بافت آسيب ديده پيوند زده شوند، چون از فرد ديگري گرفته شده­اند، مشكل دفع پيوند از سوي دستگاه ايمني ميزبان را دارند[Raff., 2003].

·         مطالعات حاكي از آن است كه اگر سلول­هاي بنيادي روياني موش به حيوان بالغي كه با دهنده سازگاري بافتي هم دارد پيوند زده شوند، احتمال بروز تومور ناشي از آن­ها خيلي زياد است[Raff., 2003].

 

·         استفاده از سلول­هاي بنيادي روياني همواره همراه با مخالفت­ها و ملاحظات اخلاقي مي­باشد [Raff., 2003].

 

1-2-2 سلول بنيادي بزرگسال

 

اين سلول­ها از بافت­هاي مختلف فرد بالغ بدست مي­آيند. در گذشته تصور مي­شد كه سلول بنيادي تنها در بافت­هاي خاصي همچون مغز استخوان، پوست و روده كه ميزان تقسيم و ريزش سلولي بالايي دارند وجود دارد. امروزه اعتقاد بر اين است كه اگر نگوئيم همه، بيشتر بافت­هاي فرد بالغ داراي سلول بنيادي هستند و يا اينكه مي­توانند در محيط كشت اين سلول­ها را توليد كنند. سلول بنيادي بزرگسال را تاكنون از بافت­هايي نظير مغز استخوان[Bianco et al., 2001]، كبد [Malouf et al., 2001]، روده [Bach et al., 2000]، مغز [Johansson et al., 1999]، نخاع [Shihabuddin et al., 2000]، ماهيچه [Williams et al., 1999]  و پوست [Toma et al., 2001] ، جدا كرده­اند.

 تا چندين سال پيش عقيده غالب آن بود كه سلول بنيادي بزرگسال پتانسيل تمايزي محدودي دارد و سلول بنيادي هر بافت تنها مي­تواند به سلول­هاي همان بافت تمايز يابد. امّا اخيراًًًً برخي محققين گزارش نموده­اند كه تعدادي از سلول­هاي بنيادي بزرگسال توانايي تمايز غير معمول را دارند به­طوري كه مي­توان آن­ها را به سلول­هاي ساير بافت­ها تمايز داد. مثلاً توانسته­اند سلول­هاي بنيادي خون­ساز را به سمت سلول­هاي عصبي و سلول بنيادي عصبي را به سمت سلول خوني تمايز دهند. اين ويژگي كه به آن انعطاف­پذيري Plasticity گفته مي­شود، نشان مي­دهد كه قدرت تمايزي سلول­هاي بنيادي بزرگسال بيش از آن چيزي است كه قبلاً تصوّر مي­شد[Bjornson et al., 1999; Brazelton et al., 2000; Mezey et al.,2000; Karause et al., 2001; Poulsom et al., 2001; Jiang et al., 2002a&2002b; Verfaillie 2002a]. طبق تعريف تراتمايز يا انعطاف­پذيري يعني اينكه سلول­هاي يك دودمان Lineage سلولي بتوانند به سلول­هاي دودمان ديگري تبديل شده و ضمن از دست دادن ماركرها و عملكرد بافت قبلي، ماركر و عملكرد بافت جديد را پيدا كنند. منظور از دودمان همان سه لايه روياني اِكتودرم، مِزودرم و اندودرم است. شگفت­انگيزتر از همه اين يافته­ها آن است كه سلول­هاي تمايز يافته مي­توانند در مواردي به حالت سلول بنيادي برگشته و سلول­هاي جديدي را توليد كنند (تمايززدايي Dedifferentiation ). مثلاً سلول­هاي تمايز يافته پشتيبان Differentiated supporting cells در اپيتليوم شنوايي جوجه مي­توانند در پي تخريب سلول­هاي مويي Hair cells، به حالت سلول بنيادي برگشته و سلول­هاي مويي جديدي را توليد كنند تا جايگزين آنها شوند. در جوندگان بالغ نيز اگر عصب محيطي قطع شود سلول­هاي شوان به سلول­هاي پيشرو شوان تمايز معكوس مي­نمايند. سپس اين سلول­ها تكثير شده و پس از ترميم آكسون مجدداً به سلول شوان تمايز مي­يابند[Raff., 2003].

 

 

 

 

استفاده از سلولهاي بنيادي در درمان بيماريهاي قلبي

تشكيل پلاك هاي آترواسكلروسيس در شريان هاي تغذيه كننده قلب،خون رساني بافت قلب بعد از محل گرفتگي بوسيله اين پلاك ها دچار اختلال مي ­شود و  اين نواحي قلب دچار ايسكمي مي گردند، اين قطع يا كاهش خون­ رساني باعث ايسكمي حاد يا مزمن بافت قلب مي ­شود كه منجر به مردن آن قسمت ازبافت زنده و تپنده قلب شده، به مرور زمان اين بافت مرده با بافت فيبروز و اسكار جايگزين شده و اين  امر  منتهي به نازك شدن ديواره بطن قلب، گشاد شدن بطن، كاهش بازده بطن و در نهايت نارسائي قلب مي  گردد  روشهايي كه امروزه به منظور درمان اين مشكلات وجود دارند كاملا فيزيكي بوده و  از طريق Pre-cutaneous Intervention  و جراحي باي پس عروق كرونر (CABG) كه تكيه بر بازگردادن خون به ناحيه ايسكمي دارند، انجام مي شود.  اين روش ­ها ايسكمي ناحيه  درگير  ديواره  قلب  را  از بين مي­برند  اما  اين  قسمت  از  بافت قلب  ظرفيت  بسيار  محدودي براي بازسازي و  نوسازي خود دارد اين امر بعلت حضور سلول­ هاي بنيادي قلبي (Cardiac Stem Cells) مي­باشد كه در قلب  وجود  دارند  اما بازسازي  بطور  بسيار كم و جزئي انجام مي­شود  و يا اصلا  انجام نمي­شود زيرا اين سلو ل ها از نظر تعداد بسيار كم  بوده  و همچنين توانائي اين سلول ها وابسته سن مي­ باشد. براي از بين بردن اين مشكل  و  بالا بردن توان بازسازي اين ناحيه از قلب سلول هاي بنيادي گزينه جديد، سلامت و مناسبي هستند كه  با  روش هاي  مختلفي  مثل  تزريق داخل اپي­كارد، داخل اندوكارد و  يا  تزريق داخل كرونري در  محل  ضايعه  قرار داده  مي­شوند. امروزه گروه ­هاي  مختلفي  در سراسر دنيا در كارآزمايي­ هاي باليني از  سلول هاي بنيادي مختلف، روش هاي مختلف تزريق  و  براي درمان بيماري­هاي مختلف قلبي استفاده كرده­اند و اكثر اين مقالات نقش سلولهاي بنيادي  را در  بهبود عملكرد قلب مثبت ارزيابي كرده اند.

 

 

 

واحد مطالعات حيواني (in vivo)

مقدمه و معرفي

واحد مطالعات در زيوه(in vivo) مركز تحقيقات قلب و عروق:

به منظور انجام، گسترش و نشر پژوهشهاي علمي-كاربردي در زمينه تحقيقات قلب و عروق، در جهت بهبود سلامت قلب و عروق افراد جامعه و لزوم انجام مطالعات حيواني در راستاي بكارگيري و آزمودن بسياري از مداخلات دارويي، مولكولي و سلولي پيشنهادي در نوع بشر، ضرورت شكل گيري چنين واحدي (واحد پژوهش حيواني) مبتني بر رعايت اصول حمايت از حيوانات ضروري به نظر ميرسيده است.

 

اهداف:

اهداف كوتاه مدت:

ايجاد شرايط مناسب (مكاني، تجهيزاتي و پرسنلي) جهت انجام تحقيقات حيواني در حيطه قلب و عروق و ساير زمينه هاي مرتبط وابسته.

انجام پژوهش هاي حيواني مبتني بر نيازهاي واقعي جامعه با رعايت اصول حمايت از حيوانات.

 

اهداف بلند مدت:

·           ايجاد بانك اطلاعاتي براساس نتايج مطالعات براي انجام تحقيقات پيشرفته تر بعدي و پرهيز از تكرار مطالعات و كاهش خطاهاي مطالعاتي بدليل نوع و شرايط خاص تحقيقات حيواني.

·           متمركز ساختن انواع مطالعات حيواني مرتبط با قلب و عروق و ايجاد يك مركز پرورش حيوانات تحقيقاتي.

·           هدفمند كردن پژوهش هاي حيواني و تلاش در تعيين اولويت هاي پژوهشي مبتني بر ارتقاي سطح سلامت جامعه

·           توليد علم و تربيت نيروي انساني محقق و توانمند در زمينه مطالعات حيواني-قلبي.

·           همكار ي علمي با ساير مراكز تحقيقاتي و آموزشي داخل كشور

·           همكار ي علمي با ساير مراكز تحقيقاتي و آموزشي خارج كشور و جذب grant هاي بين المللي

·           ارزشيابي ادواري عملكرد واحد جهت ارتقاء سطح كارآمدي

 

 بخش پژوهشهاي حيواني مركز تحقيقات قلب و عروق،  با مشاركت ساير بخشهاي مركز به منظور انجام تحقيقات مختلف و ارائة روشهاي جديد ارائه شده در حوزة قلب و عروق بر روي حيوانات آزمايشگاهي در سال 1388 راه اندازي شده است كه درنتيجه عملكرد صحيح اين مركز ساير مراكز علمي تحقيقاتي نيز توانسته اند از امكانات آن جهت انجام تحقيقات استفاده نمايند. در حال حاضر اين واحد در ساختماني كه به همين منظور در طبقه همكف مركز ساخته شده فعال مي باشد. اين ساختمان با مساحتي حدود 100 متر داراي بخشهاي زير مي باشد:

·         بخش نگهداري حيوانات

·         بخش جراحي حيوانات

·         بخش آزمايشگاه مولكولي

 

امكانات

آزمايشگاه حيوانات كوچك آزمايشگاهي

در اين بخش از مركز تحقيقات انواع مدلهاي بيماري هاي قلبي از جمله ايسكمي حاد، ايسكمي مزمن، هايپرتروفي قلبي و همچنين قلب ايزوله ايجاد ميشوند.

 

 

Animal House

در اين بخش از واحد مطالعات in vivo رت آزمايشگاهي به منظور آزمايشهاي in vivo و مدلهاي بيماري هاي قلبي تكثير و نگهداري ميشوند. اين بخش همچنين در فروش رت آزمايشگاهي ارائه خدمات مينمايد.

 

 

توانمنديهاي آزمايشگاه جراحي حيوانات :

* ايجاد مدلهاي حيواني بيماري

¨ توانمندي در ايجاد مدلهاي حيواني بيماريهاي متابوليك ديابت نوع 1 و نوع 2 بر روي رت.

¨ توانمندي در ايجاد  مدلهاي حيواني ايسكمي حاد و ايسكمي- رپرفيوژن بافت قلبي بر روي رت.

¨ توانمندي در ايجاد  مدلهاي حيواني ايسكمي حاد و ايسكمي- رپرفيوژن بافت مغز بر روي رت.

¨ توانمندي در ايجاد  مدلهاي حيواني ايسكمي حاد و ايسكمي- رپرفيوژن بافت كليه بر روي رت.

¨ توانمندي در ايجاد  مدلهاي حيواني ايسكمي حاد و ايسكمي-رپرفيوژن بافت كبد بر روي رت.

¨ توانمندي در ايجاد  مدلهاي حيواتي آترواسكلروزيس بر روي رت.

¨ توانمندي در ايجاد مدلهاي حيواني سيروز كبدي بر روي رت.

¨ توانمندي در ايجاد مدلهاي حيواني ام اس  بر روي رت.

¨ توانمندي در ايجاد مدلهاي حيواني صرع بر روي رت.

 در آزمايشگاه جراحي حيوانات، مدلهاي مرتبط با آسيبهاي ناشي از ايسكمي و ايسكمي رپرفيوژن قلبي در قالب طرحهاي تحقيقاتي تهيه و تدوين شده است . تعدادي از اين طرحها به اتمام رسيده و مابقي آنها مراحل انتهايي خود را سپري مينمايد.

 

 

طرح هاي پژوهشي

 انجام ارزيابيهاي مولكولي ژنهاي درگير در پاتوژنز بيماريها:

تعدادي از طرحهاي پژوهشي اجرا شده ويا در مرحله اجرا و تدوين در اين واحد به قرار زير ميباشد:

·                       بررسي و ارزيابي ژنهاي درگير در بروز التهاب متعاقب ايجاد ايسكمي حاد و ايسكمي-رپرفيوژن در بافت قلبي.

·                      نقش سيستم ايمني ذاتي در پاتوژنز بيماريهاي ايسكميك قلبي.

·                       اهميت گيرنده هاي شناسايي الگو(Pattern recognition receptors) در پاتوژنز بيماريهاي ايسكميك قلب.

·                     بررسي الگوي زماني Initiator caspases(Caspases 2, 8,9 and 10) و  caspases(Caspases 3, 6 and 7)  متعاقب ايجاد آسيب ايسكمي حاد و ايسكمي- رپرفيوژن در بافت قلب رت.

·                       بررسي سير زماني ژنهاي درگير در سيتم ايمني ذاتي در بيماري ديابت نوع 1.

·                       بررسي ژنهاي گيرنده انسولين ايزوفورم 1 و 2 متعاقب مصرف تيوسولفيت سديم (بلانكيت) در رتهاي نر نژاد ويستار.

·                       بررسي ميزان بيان ژنهاي ناقل گلوكز (Glucose Transferase= GLUT) 1 تا 4 در شرايط هايپرگليسمي القاء شده ديابت نوع 1 و 2 در بافتهاي پانكراس و كبد رتهاي نر نژاد ويستار.

·                       بررسي ميزان بيان GLUT 1-4 در مدلهاي حيواني مبتلا به ايسكمي حاد قلبي.

 

 

مدلهاي حيواني ايسكمي و ايسكمي قلبي در رت:

بيماري هاي شريان كرونري شايعترين علت مرگ و مير در سرتاسر جهان مي باشند و سالانه بيش از 7 ميليون انسان به علت ابتلا به اين بيماري ها جان خود را از دست مي­دهند كه در اين ميان سهم مردان و زنان به ترتيب، 8/3 ميليون و 4/3 ميليون نفر است[1]. در انسان، آسيب برگشت ناپذير بافت عضلة قلبي كه معمولاً در هنگام بروز انفاركتوس قلبي ايجاد مي­شود، معمولاً 20 دقيقه بعد از بروز ايسكمي كامل در ناحية بافت قلبي به وجود مي­آيد. برقراري مجدّد جريان خون (رپرفيوژن[1]) براي نجات و بقاء كارديومايوسيت هاي در معرض ايسكمي ضروري است و انجام رپرفيوژن اوليه، به عنوان يك استراتژي مؤثر و درمان اوليه براي كاهش اندازة ناحية دچار سكته در بيماران دچار انفاركتوس حاد ميوكاردي اتخاذ مي­شود[1]. در عين حال برقراري مجدّد جريان خون به ناحية دچار ايسكمي، واكنش هايي را به راه مي­اندازد كه در نهايت مي­تواند منجر به بروز آپوپتوزيس و مرگ سلول هاي ميوكاردي گردد[2]. در واقع آسيب رپرفيوژنِ كشنده[2]، به عنوان آسيب ميوكاردي كه به واسطة بازگشت تأخيري جريان خون كرونري[3]، بعد از يك دورة ايسكمي ايجاد مي شود، شناخته شده است[2]. اين آسيب با مرگ كارديومايوسيت ها كه قبل از بروز رپرفيوژن ميوكاردي، زنده بوده اند به اوج خود مي رسد[3]. در نتيجه، اندازة ناحية انفاركتوس افزايش يافته و تأثير مفيد اين بازگشت مجدّد جريان خون به ناحية دچار ايسكمي را كاهش مي­دهد[2]. از طرف ديگر شناسايي علت دقيق مرگ سلولي ناشي از رپرفيوژن و ايسكمي و مكانيسمهاي مولكولي درگير در بروز و توسعه اين آسيب­ها دشوار بوده و تاكنون اين علت ها مورد بحث و بررسي قرار گرفته است؛ به طوري كه تعميم تنها يك مسير پيام رساني خاص در بروز و توسعه مرگ سلولي و عوارض ناشي از آن پيچيده و مشكل است.

    بافت ميوكارديال در ناحية پرفيوژن يك شريان كرونري مسدود شده، از يك هسته مركزي نكروتيك تشكيل شده است. كه در طول ايسكمي ميوكارد از اندوكارديوم تا اپي­كارديوم توسعه پيدا كرده است و توسط يك ناحية مرزي از كارديومايوسيتهاي در معرض خطر كه سرنوشت آنها نا­مشخص است، احاطه شده است. رپرفيوژن، پيشروي ناحيه نكروتيك مركزي را محدود مي­كند اما باعث راه اندازي رويدادهاي مولكولي مي شود كه منجر به آسيب رپرفيوژن كشنده در ناحية مرزي مي­شود. هستة نكروتيك، ناحية مرزي ايسكميك و بافت ميوكاردي رپرفيوژ شده، منابع مشخص ميانجي­هايي هستند كه مي­توانند توسط مسيرهاي شناسايي الگو شناسايي شوند. هنوز مشخص نيست كه آيا رپرفيوژن باعث بيان راه­اندازهاي مختلف پاسخ التهابي مي شود يا اين حالت طي فرآيند ايسكمي به وجود مي آيد.گذشته از آن، يك پاسخ سيستميك در بدن ايجاد مي­شود كه ناشي از ميانجي­هاي آزاد شده از بافت ميوكارديال آسيب ديده و سلولهاي فعال شدة گردش خون مي­باشد. يك فهم دقيق­تر از اينچنين موضوعاتي قبل از اتخاذ مداخلات درماني لازم است كه صورت پذيرد. در پژوهشهاي صورت گرفته در مركز سعي برآن شده است تا يك مسير سيگنالي كه در آسيب ايسكمي و رپرفيوژن نقش دارد به طور كامل از گيرنده هاي سطح سلولي و داخل سلولي(اندوزومال)، همچنين آداپتورهاي رابط سيتوپلاسمي و هسته اي، و در نهايت سايتوكاينهاي التهابي كه در انتهاي مسير قرار دارند در سطح mRNA و برخي در سطح پروتئين سنجيده شود كه مراحل اجرايي كار را ميگذراند.

 

مدل حيواني بيماري ديابت

مدل حيواني بيماري ديابت:

بيماري ديابت يك بيماري مخرّب است كه به دو دسته اوّليه و ثانويه تقسيم مي­شود. 5 درصد افراد ديابتي در دنيا، داراي ديابت نوع1 هستند. ديابت نوع2، 95 درصد بيماران ديابتي را تحت تأثير قرار مي دهد. ديابت نوعي بيماري متابوليك است كه با هايپرگلايسمي مزمن، همراه با اختلال در متابوليسم كربوهيدرات، چربي و پروتئين، ناشي از نقص در ترشح انسولين، عملكرد انسولين، يا هر دو تشخيص داده مي­شود. هيپرگلايسمي مزمن در ديابت، با آسيب بلند مدت، عدم عملكرد و ناتواني اندام­هاي مختلف، از جمله چشم، كليه، اعصاب، قلب، و رگ­هاي خوني مرتبط است.

تكرر ادرار، تشنگي بيش از حد، كاهش وزن، وگاهي اشتهاي زياد، و ديد تيره از علائم مشخص هيپرگلايسمي مي­باشند. اختلال در رشد و حساسيت به عفونت هاي مختلف نيز ممكن است با هيپرگلايسمي مزمن همراه باشند.

در حالات بسيار شديد، ممكن است كتواسيدوز يا يك حالت هاپيراسمولار غيركتوزي پيشرفت كرده و منجر به بي حسي، كما، و در غياب يك درمان موثر، مرگ شود. اين علائم اغلب شديد نبوده يا ممكن است حضور نداشته باشند، در نتيجه هيپرگلايسمي لازم براي ايجاد تغييرات پاتولوژيكي و عملكردي ممكن است مدت­ها پيش از تشخيص ديابت حضور داشته باشد.

همواره ارتباط تنگاتنگي مابين بيماري ديابت و شرايط هايپرگليسميك و عوارض تأخيري ديابت از جمله كارديوميوپاتي، نوروپاتي، نفروپاتي و رتينوپاتي وجود دارد. در اين راستا، واحدهاي جراحي حيوانات مركز، طرحهاي تحقيقاتي در اين حوزه را در اولويت بعدي خود قرار داده است.

در حال حاضر مدلهاي حيواني ديابتي نوع 1 و 2 در اين واحد  قابل تهيه ميباشد.

 جهت القاء ديابت نوع 1 و ايجاد  هايپرگلايسمي حاد،  از استرپتوزوتوسين با دز mg/kgBW 55  استفاده ميگردد. براي حل نمودن STZ بافر سيترات مورد استفاده قرار ميگيرد. بدين منظور 12/10 گرم مونوسيترات سديم در 100  ميلي­ليتر آب مقطر حل شده و با استفاده از اسيد سيتريك pH آن به 2/4 ميرسد. پس از استريله شدن بافر در دستگاه اتوكلاو، به ازاي هر رت، STZ در5/0 ميلي­ليتر بافر حل شده و به صورت ناشتا و به طور داخل صفاقي تزريق خواهد گرديد.

دو روز پس از تزريق، قند خون ناشتاي رت­ها با استفاده از دستگاه گلوكومتر مورد ارزيابي قرار ميگرد. براي بررسي تداوم هيپرگلايسمي در طول دوره آزمايش، قند خون و وزن رت­ها بطور مرتب اندازه­گيري ميشود.

 

همچنين براي ايجاد مدلهاي حيواني ديابت نوع 2 از موش‌هاي صحرايي نر 2 ماهه استفاده ميشود كه به منظور القاي ديابت نوع دو، به مدت 2 ماه غذاي معمولي و آب حاوي فروكتوز با غلظت (w/v) 10%  دريافت ميكنند. اين روند به مدت 8 هفته ادامه داشته تا ديابت نوع دو القا گردد. جهت اطمينان از ايجاد ديابت نوع دو، تست تحمل گلوكز انجام و ميزان وزن و قند خون نيز مورد بررسي قرار ميگيرد. پس از اندازه گيري‌هاي مربوطه و انجام تست تحمل گلوكز و آناليزهاي آماري ايجاد ديابت نوع دو در اين گروه مورد تاييد قرار ميگيرد. پس از آن، تيمار حيوان‌هاي اين گروه به مدت 2 ماه ديگر يعني تا سن 6 ماهگي با غذاي معمولي و آب حاوي فروكتوز ادامه خواهد يافت.

قند خون حيوان ها بطور مرتب اندازه گيري ميشود. جهت انجام اين كار، خون گيري از دم با استفاده از تيغ و با ايجاد يك برش كوچك صورت مي‌گرفت. تعيين سطح گلوكز با استفاده از يك قطره خون و دستگاه گلوكومتر Bionime صورت ميگيرد. همچنين خون گيري به منظور تعيين يكسري فاكتورهاي بيوشيميايي از قبيل گلوكز، انسولين، تري گليسريد، كلسترول، LDL و HDL نيز پيش از كشتن موش‌هاي صحرايي انجام ميشود. تست تحمل گلوكز براي دو گروه كنترل و ديابتي نوع دو انجام ميگيرد. براي انجام اين تست حيوانات  مي‌بايست ناشتا باشند. بدين منظور 12 ساعت قبل از انجام تست تحمل گلوكز، غذا و آب حاوي فروكتوز برداشته شده و تنها آب معمولي به حيوانات داده ميشود. سپس قند خون ناشتاي اين حيوانات با استفاده از روشي كه در بالا ذكر شد اندازه گيري ميگردد. پس از آن، محلول 40% گلوكز با غلظت 2 گرم به ازاي هر كيلوگرم وزن بدن به صورت داخل صفاقي به حيوان تزريق شده و غلظت گلوكز خون در زمان 30، 60 و 120 دقيقه پس از تزريق گلوكز مورد ارزيابي قرار ميگيرد. داده‌هاي بدست آمده به صورت نمودار تست تحمل گلوكز ارائه ميشود. مساحت زير منحني نيز به عنوان معياري براي سنجش ابتلاي حيوانات به ديابت نوع دو محاسبه ميگردد. شاخص مقاومت به انسولين ناشتا ملاكي براي تعيين ايجاد ديابت نوع دو در حيوانات مي‌باشد. جهت محاسبه فاكتور FIRI از فرمول ذيل استفاده ميشود:

FIRI= 

براي اندازه گيري فاكتورهاي بيوشيميايي از حيوان‌هاي گروه‌هاي تجربي (قبل و بعد از تيمارهاي مورد نظر) و نيز گروه كنترل خون گيري صورت ميگيرد. خون گيري از سينوس چشمي و با استفاده از لوله‌هاي هماتوكريت انجام ميشود. بدين منظور ابتدا موش ها تحت بيهوشي با اتر قرار گرفته و سپس يك لوله موئينه (لوله هماتوكريت) وارد گوشه داخلي چشم ميگردد. در اين حالت، خون به سرعت از سينوس چشمي وارد لوله موئينه شده و از آن خارج مي‌شود. از نمونه‌هاي خون گرفته شده سرم تهيه خواهد شد. بدين ترتيب كه ابتدا خون با سرعت rpm 4000 براي 15 دقيقه سانتريفيوژ شده و سپس سرم از روي لخته خون برداشته شده و به يك ويال تميز منتقل ميشود. نمونه‌هاي سرم در دماي 20- درجه تا زمان اندازه گيري فاكتورهاي بيوشيميايي نگهداري ميشوند. گلوكز، تري گليسيريد، انسولين، كلسترول، LDL و HDL و همچنين هورمون‌هاي LH، FSH و تستوسترون توسط كيت‌هاي مخصوص در آزمايشگاه جهاد دانشگاهي مشهد مورد سنجش قرار خواهند گرفت. 

تاكنون عوامل متعددي براي بروز بيماري ديابت پيشنهاد شده است كه از آن­جمله مي­توان به كم­تحركي، چاقي، مصرف دخانيات و مواد مخدر و نوشابه­هاي الكلي، بالابودن چربي­هاي مضر خون مانند LDL و VLDL، استفاده از روغنهاي جامد ومايع، پرخوري، شوكهاي روحي و غم و افسردگي، استرس بالا كه سبب بالارفتن هورمون كورتيزول و بالارفتن مقاومت انسوليني در بدن مي­گردد، استفاده خودسرانه از داروها به خصوص استامينوفن، فست فودها و... اشاره كرد. به تازگي پاره­اي از بررسيهاي محلّي صورت گرفته، گزارش داده­اند كه استفاده از قند و شكر و نبات و شيريني­هاي مصنوعي، به علت وجود مادة سفيد كننده با نام جوهر قند(بلانكيت يا هيپوسولفيت سديم) در آنها مي­تواند در درازمدت منتهي به بروز بيماري ديابت گردد. ولي تاكنون به طور قطعي و مستندِ علمي اين فرضيه به تأئيد نرسيده است و گزارشات متناقضي در اين مورد مطرح است.

با توجه به مصرف بيش از اندازة اين مادة شيميايي در كارگاههاي شيريني سازي و توليد قند و نبات و همچنين ميزان بالاي مصرف قندهاي سنتي در سطح خانواده­ها و نيز با درنظرگرفتن ميزان بالاي شيوع بيماري ديابت در جامعه، به نظر مي­رسد كه مصرف طولاني­مدت اين مادة شيميايي مي­تواند اثر ديابت زايي (Diabetogenic) داشته باشد.

تا به امروز شواهدي مستند بر اثر ديابت­زايي بلانكيت به طور تلويحي تأئيد و يا رد نشده است، همچنين تاكنون مكانيسمهاي مولكولي دقيقي كه اين اثر را تأئيد نمايد، انجام نگرفته است. درموارد متعددي عنوان شده است كه حتي مصرف اين مادة شيميايي مي­تواند اثر آنتي­اكسيداني داشته باشد. از آنجائيكه تا به امروز هنوز اثر ديابت­زايي يا آنتي­اكسيداني مادة شيميايي هيپوسولفيت سديم، متعاقب مصرف آن به روشني مورد تأئيد قرار نگرفته است، به نظر مي­رسد كه در اين روند، نقش ناقلين گلوكز و گيرنده­هاي انسوليني بسيار مشهود باشد. به طوري كه در حالت طبيعي عملكرد ناقلين گلوكز و انسولين در حفظ هموستازي گلوكز تعيين كننده بوده و فقدان عملكرد طبيعي آنها مي­تواند منجر به بروز انواع بيماريهاي متابوليك از جمله ديابت گردد. به نظر مي­رسد كه عدم تعادل در حفظ حالت آنتي­كسيداني و اكسيداني سلول كه توسط مسيرهاي پيام رساني متعددي ميانجيگري مي­شود مي­تواند در نهايت منجر به بروز حالت پاتوژنيك ديابت در فرد گردد. گذشته از بحث اكسيداني و يا غير اكسيداني بلانكيت، توجه به اين نكته ضروري است كه همواره در حفظ تعادل وهومئوستازي گلوكز در بدن، گيرنده­هاي متعددي درگير هستند كه از آنجمله مي­توان به گيرنده­هاي انسوليني اشاره نمود. به همين دليل، «عدم حساسيت به انسولين»، و يا كاهش در مسيرپيام رساني گيرندة انسولين، منجر به بروز ديابت نوع 2 مي­گردد كه در اين وضعيت، درنهايت سلولها قادر به برداشتن گلوكزخون نبوده كه در نتيجه منجر به بروز هايپرگليسمي و تمام پيامدهايي مي­شودكه در نهايت منجر به بروز ديابت مي­گردد.  يكي از اثرات نهايي انسولين در بدن، افزايش مولكول ناقل گلوكز شمارة 4 (GLUT4)، با ميل تركيبي بالاي اتصالي به گلوكز برروي غشاء خارجي سلولهاي بافتهاي حساس به گلوكز است كه در نهايت منجر به برداشت گلوكز از خون به داخل اين سلولها مي­شود. به بيان ديگر، متعاقب اتصال انسولين به گيرندة غشائي آن، ناقل GLUT4گلوكز، از وزيكولهاي سلولي به سطح سلول انتقال داده شده ودر غشاء پلاسمايي سلول درج مي­گردد. در نهايت، گلوكز از طريق اين ناقلين گلوكز، به داخل سلول منتقل مي­شود. با توجه به اينكه يكي از علل بيماري ديابت مقاومت به انسولين( عدم حساسيت به انسولين) مي­باشد سؤال ديگري كه در اين طرح به دنبال پاسخگويي به آن هستيم اين است كه استفاده از بلانكيت، ميزان بيان ژنهاي گيرندة انسولين را افزايش مي­دهد يا خير.

 

به طوركلي، در اين طرح، اثر تجويز مادة شيميايي هيپوسولفيت سديم در دوزهاي مختلف، بر روي سطوح سرمي گلوكز و انسولين خون مورد بررسي قرار گرفته است. همچنين ميزان بيان ژن گيرندة انسولين متعاقب استفاده از مادة هيپوسولفيت سديم در بافت پانكراس ارزيابي خواهد شد.