دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد
Real Time PCR

تكنيك Real-time PCR

Real-time PCR نوعي از آزمايش PCR استاندارد است كه طي آن، ميزان محصولات توليدشده همزمان با انجام فرايند بررسي مي‌شود.

Real-time PCR كه Quantitative PCR نيز ناميده مي‌شود، تكنيكي است كه به طور گسترده در بررسي‌هاي كمي بيان ژن به كار مي‌رود. Real-time PCR همچنين روشي بسيار قدرتمند و حساس در تعيين تعداد ويروس‌هاي موجود در يك نمونه است. ويژگي كليدي Real-time PCR، فراهم شدن امكان بررسي تكثير قطعات DNA همزمان با انجام گرفتن آزمايش و با استفاده از گزارشگرهاي فلوئورسنت (fluorescent reporters) مي‌باشد. قدرت سيگنال فلوئورسنت توليدشده ارتباط مستقيمي با مقدار مولكول‌هاي تكثيرشده دارد. اين تكنيك در تست‌هاي مختلف تشخيصي، جاي PCR عادي را گرفته است.

آزمايش PCR از زمان معرفي‌اش تاكنون، كاربردهاي گسترده‌اي در زمينه‌هاي مختلف مانند كلون كردن ژن، نقشه‌برداري ژني، تشخيص جهش‌ها، توالي‌يابي DNA و تعيين هويت افراد داشته‌است. آزمايش PCR همچنين مي‌تواند در سنجش ميزان بيان ژن‌ها مورد استفاده قرار گيرد و مثالي براي اين كاربرد تكنيك Competitive PCR است. اين تكينك از جمله روش‌هايي است كه براي سنجش ميزان mRNA توليدشده در حين رونويسي يك ژن خاص به كار مي‌رود. محصولات توليدشده طي Competitive PCR در پايان فرايند و طي الكتروفورز و يا densitometry بررسي مي‌شوند و حين انجام واكنش امكان آناليز آن‌ها وجود ندارد. اين به آن معني است كه مشاهده نتايج تنها پس از كامل شدن واكنش و انجام يك سري فرايندهاي ديگر ممكن خواهد شد.

در روش Real-time PCR نياز به اين دستكاري‌ها برطرف شده است و همين موضوع از مزيت‌هاي اين تكنيك است و خطر آلودگي را كاهش مي‌دهد. همچنين از ديگر مزاياي استفاده از آزمايش Real-time PCR به منظور سنجش ميزان بيان ژن‌ها، حساسيت آن‌ است؛ به اين معني كه مي‌تواند حتي يك كپي از رونوشت موردنظر را تشخيص دهد.

ايجاد فناوري‌ها و نوآوري‌هاي جديد در زمينه تجهيزات و نيز رنگ‌هاي فلوئوروسنت و وسايل تشخيص آن‌ها باعث شد كه روش‌هاي Real-time PCR توسعه پيدا كنند، كه مي‌توانند محصولات PCR را حين توليد در چرخه‌هاي متوالي، به صورت real-time تشخيص دهند. اين تكنيك‌ها همچنين امكان بررسي چندين ژن به صورت همزمان را فراهم مي‌كنند. اما استفاده از آن‌ها مشكلاتي نيز به همراه دارد؛ از جمله اين كه راه‌اندازي آن‌ها سخت‌تر از PCR استاندارد است.

انواع مختلفي از Quantitative PCR وجود دارد كه نوع مورد استفاده بسته به هدف ما از انجام آزمايش مي‌باشد. دو حالت كلي وجود دارد: 1- اگر هدف ما تنها تشخيص يك ژن و نه اندازه‌گيري ميزان بيان آن باشد، از Q-PCR پايه (Real-time) استفاده خواهيم كرد. در اين حالت، از داده‌هايي كه حين واكنش توليد مي‌شوند استفاده مي‌كنيم تا ميزان محصولات توليدشده را با گذشت زمان و حين انجام آزمايش بسنجيم. 2- اگر هدف، سنجش ميزان بيان يك ژن خاص باشد، Real-time RT-PCR مورد استفاده قرار خواهد گرفت. به اين صورت كه مجبوريم پيش از آغاز فرايند Quantitative PCR، استخراج RNA و تبديل آن به cDNA را انجام دهيم. اساس اين تكنيك، ارتباط مقدار RNA رونويسي شده به ميزان بيان ژن موردنظر است و مي‌توان با استفاده از آن ميزان بيان ژ‌ن‌ها را در شرايط مختلف مقايسه كرد.

روش‌هاي انجام Real-time PCR

تكنيك Quantitative PCR امكان پي‌بردن به مقدار نوكلئيك اسيد اوليه موجود در نمونه را براي ما فراهم مي‌كند. مقدار محصولي كه پس از طي‌شدن تعداد چرخه‌هاي مشخصي از PCR توليد مي‌شود، بستگي به ميزان نوكلئيك‌اسيد اوليه دارد. اگر در آغاز PCR، مقدار اين مولكول‌ها كم باشد، محصول كمي توليد خواهد شد و برعكس اگر مولكول‌هاي آغازكننده واكنش زياد باشند، مقدار محصولات نيز زياد خواهد بود. اين موضوع، اساس تعيين مقدار مولكول‌هاي اوليه حاضر در عصاره سلولي را تشكيل مي‌دهد.

تعداد قطعات كوتاه سنتز شده پس از طي‌شدن 25 چرخه PCR؛ تعداد مولكول‌هاي آغازگر اين چرخه‌ها با همديگر متفاوتند. اين اعداد با فرض بازده 100 درصدي فرايند و صرف نظر از محدود شدن مواد اوليه درج شده‌اند.

در Quantitative PCR، ميزان محصولاتي كه حين يك آزمايش PCR توليد مي‌شوند با ميزان محصولات توليدشده طي آزمايش‌هاي PCRي با مقدار نوكلئيك‌اسيد آغازكننده مشخص، مقايسه مي‌شود. در روش‌هاي اوليه Quantitative PCR، الكتروفورز در ژل آگارز به منظور انجام چنين مقايسه‌هايي به كار مي‌رفت. پس از رنگ‌آميزي ژل، شدت رنگ نوارهاي از پيش تعيين‌شده با شدت رنگ نوار آزمايش مقايسه مي‌شد تا بيشترين شباهت تعيين شود و از روي آن ميزان نوكلئيك اسيد اوليه نمونه مورد آزمايش به دست آيد. اين فرايند عليرغم آسان و انجام پذيرتر بودن، داراي دقت كمي است. اين موضوع از آن‌جا ناشي مي‌شود كه وجود تفاوت‌هاي قابل‌توجه در ميزان نوكلئيك‌اسيد اوليه خود را به صورت تفاوت‌هايي اندك در شدت رنگ نوار محصولات در الكتروفورز نشان مي‌دهند.

استفاده از الكتروفورز در ژل آگارز براي تعيين ميزان DNA موجود در آزمايش PCR؛ نوارهاي 1 تا 4 آزمايش‌هاي PCR كنترل و از پيش تعيين شده هستند كه به ترتيب ميزان DNA الگوي آن‌ها كاهش يافته است. شدت رنگ‌آميزي PCR تست، مشابه نوار كنترل 2 است؛ درنتيجه اين دو PCR تقريبا داراي ميزان الگوي يكساني هستند.

دو روش كلي براي انجام Real-time PCR معرفي شده‌ است:

 

مي‌توان به مخلوط PCR رنگي را افزود كه با اتصال به DNA دورشته‌اي سيگنال فلوئوروسنت ايجاد مي‌كند. اين رنگ SYBR green نام دارد و استفاده از آن ارزان‌تر و ساده‌تر است. اين تكنيك ميزان كل DNAهاي دورشته‌اي موجود را حين انجام PCR و در هر زماني گزارش مي‌دهد. در طول هر چرخه Real-time PCR ميزان سيگنال فلوئوروسنت با افزايش بيشتر و بيشتر DNAهاي دورشته‌اي كه به SYBR green متصل مي‌شوند، افزايش پيدا مي‌كند. البته ممكن است مقدار گزارش‌داده شده بيشتر از مقدار واقعي باشد. علت اين موضوع اتصال غيراختصاصي پرايمرها به همديگر و توليد دايمر پرايمر، توليد محصولات غيراختصاصي و درنتيجه افزايش يافتن مقدار DNAهاي دورشته اي است.

تكنيك ديگر استفاده از پروب گزارشگري (reporter probe) است كه با اتصال به محصولات PCR سيگنال فلوئوروسنت ايجاد مي‌كند و استفاده از آن معمول‌تر است. اين تكنيك به Taq Man 5’ nuclease assay معروف است. پروب به كار رفته در اين فرايند از آن جهت reporter ناميده شده كه نشانگر وجود محصول موردنظر است. محل اتصال پروب، به رشته الگو و نزديك به پرايمرهاي اصلي PCR و پايين‌تر از آن است. اين متد كمتر در معرض خطاهايي قرار دارد كه از اتصالات نادرست از جمله دايمرهاي پرايمر حاصل مي‌شود. در اين حالت هر مولكول پروب متشكل از يك اليگونوكلئوتيد و دو ليبل است. رنگ فلوئوروسنت به انتهاي 5’ رشته اليگونوكلئوتيدي و تركيب quencher به انتهاي ديگر رشته متصل مي‌شود. اين تركيب وظيفه مهار سيگنال فلوئوروسنت را بر عهده دارد و اين كار را با جذب انرژي از رنگ فلوئوروسنت انجام مي‌دهد. اين پديده FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) نام دارد. در حالت عادي سيگنال فلوئوروسنتي ايجاد نمي‌شود؛ چون اليگونوكلئوتيد به گونه‌اي طراحي شده است كه دو انتهاي آن با همديگر مكمل شده و رنگ فلوئوروسنت و تركيب quencher در كنار همديگر قرار مي‌گيرند. هيبريداسيون بين اليگونوكلئوتيد و محصول PCR، اتصال بين دوسر اليگونوكلئوتيد را بر هم مي‌زند و اين كار باعث ايجاد سيگنال فلوئوروسنت مي‌گردد. در حين انجام‌شدن PCR، پليمراز Taq، با رسيدن به پروب با خاصيت اگزونوكلئازي 3’ به 5’ خود آن را تجزيه مي‌كند و با اين كار رنگ و تركيب quencher در محيط آزاد مي‌گردند. هر چه محصولات توليدشده بيشتر باشند، پروب‌هاي بيشتري به توالي مكمل خود در اين محصولات متصل مي‌شوند. هر چه تعداد پروب بيشتري متصل شود، سيگنال فلوئوروسنت بيشتري حين آزاد شدن رنگ از quencher ايجاد مي‌گردد. درنتيجه ارتباطي ميان سيگنال‌هاي فلوئوروسنت ايجادشده در Real-time PCR و مقدار توالي الگو وجود دارد.

هيبريداسيون پروب reporter به DNA هدف

هر دو اين روش‌ها (استفاده از رنگ SYBR green و يا پروب Taq Man) امكان سنجش سيگنال فلوئورسنت را به دنبال توليد محصولات PCR فراهم مي‌آورند. اين تكينك‌ها وسيله قابل‌اتكايي براي سنجش ميزان اسيدنوكلئيك‌ها و نيز تشخيص وجود و يا عدم وجود يك توالي خاص هستند. انواع مختلفي از سخت‌افزارها براي انجام real time PCR وجود دارد و دستگاه‌هاي پرسرعت مي‌توانند يك آزمايش PCR را در مدت زماني كمتر از 30 دقيقه انجام دهند. Real-time PCR به سرعت به سمت اتوماسيون پيش رفته‌ است، تا جايي كه به بهترين روش انجام Quantitative PCR مبدل گشته است. تجهيزات اوليه انجام اين فرايند بسيار گران‌قيمت بوده‌اند، اما دستگاه‌هاي نسل دوم، با قيمت‌هاي معقول‌تري به صورت تجاري در دسترس مي‌باشند.

 

تكينك‌هاي بسياري براي تشخيص پروب‌هاي الگونوكلئوتيدي وجود دارند و دستگاه‌هاي متعددي نيز براي انجام Real-time PCR ايجاد شده‌اند. از جمله تفاوت‌هاي اين دستگاه‌ها، مكانيسم چرخه‌هاي حرارتي و سيستم‌هاي اپتيك است. Taq Man و Lightcycler از تكنولوژي فلوئورسانس براي تشخيص جهش‌ها با مكانيسم تمايز آللي (allelic discrimination) بهره مي‌گيرند. شكل زير نشان‌دهنده انجام واكنش real time PCR براي تشخيص فاكتور V ليدن است.

 

real time PCR

واكنش real time PCR براي تشخيص جهش فاكتور V ليدن؛ تصوير B نمودار تعيين ژنوتيپ به روش Taq Man است. هر نمونه با دو پروب بررسي شده است. يكي از پروب‌ها اختصاصي آلل طبيعي (wild type) و ديگري اختصاصي آلل جهش‌يافته است. شدت فلوئورسانس مربوط به هر پروب روي نمودار ترسيم شده است. آلل طبيعي روي محور x و آلل جهش‌يافته بر روي محور y است و هر نمونه با يك نقطه نشان داده شده است. نمونه‌ها بر اساس ژنوتيپ به سه دسته تقسيم شده‌اند: هموزيگوت سالم، هموزيگوت جهش‌يافته و هتروزيگوت.

پس از انجام مراحل فوق، تعيين نتيجه آزمايش Real-time PCR نيازمند انجام مقايسه ميان PCRهاي تست و كنترل است. اين مقايسه با مشخص‌نمودن مرحله‌اي صورت مي‌گيرد كه در آن ميزان سيگنال‌هاي فلوئوروسنت به آستانه‌اي كه از پيش تعيين شده است، برسد. هر چه آزمايش PCR مورد بررسي زودتر به اين دامنه برسد، به آن معني است كه مقدار DNA موجود در مخلوط اوليه واكنش بيشتر است.

 

 

تعيين مقدار DNA توسط تكنيك real-time PCR ؛ اين نمودار روند سنتز محصولات را طي سه PCR با مقادير متفاوت DNA آغازگر نشان مي‌دهد. حين PCR، محصولات به صورت نمايي تجمع مي‌يابند. ميزان محصولات موجود در هر چرخه Real-time PCR مشخص متناسب با مقدار DNA آغازگر فرايند Real-time PCR است. درنتيجه، منحني آبي بيشترين و منحني سبز كمترين ميزان از DNA آغازگر را دارد. اگر مقدار DNA اوليه در اين سه چرخه را بدانيم، خواهيم توانست اين مقدار را در PCR تست و به كمك اين كنترل‌ها به دست آوريم. در عمل مقايسه از طريق تعيين شماره چرخه‌اي كه طي آن ميزان محصولات از حد آستانه بالاتر مي‌رود، انجام مي‌گيرد. اين آستانه در شكل با خطي افقي مشخص شده است.

مراحل Real-time PCR

در يك آزمايش PCR توالي DNA هدف به صورت نمايي تكثير مي‌شود؛ به اين صورت كه يك الگو به دو، دو الگو به چهار و چهار الگو به هشت الگو تبديل مي‌شود و اين روند ادامه پيدا مي‌كند. در نگاه اول اين موضوع درست به نظر مي‌رسد. با اين‌حال، تكثير نمايي نمي‌تواند تا ابد ادامه يابد و معمولا تا چرخه 35ام سرعت واكنش كاهش خواهد يافت. در اين حالت، پرايمرها و dNTPها مثل قبل به مقدار زياد وجود ندارند؛ از بازده DNA پليمراز كاسته شده است؛ دناتوره‌شدن DNAها به صورت كامل انجام نمي‌گيرد؛ و محصولات واكنش توسط خاصيت نوكلئازي پليمراز از بين مي‌روند. با وقوع موارد گفته‌شده، واكنش وارد يك فاز خطي مي‌شود. در اين حالت مانند فاز لگاريتمي توالي‌هاي الگو به طور كامل دو برابر نمي‌شوند. تا اينكه درنهايت تا چرخه 40ام، واكنش وارد مرحله كفه (plateau) مي‌شود كه توقف تكثير اتفاق مي‌افتد.

 

پس واكنش PCR قابل تقسيم به چهار فاز كلي است: فاز اوليه، linear ground phase نام دارد. در اين مرحله ‌PCR به تازگي شروع شده است و سيگنال حاصل از سيگنال پس‌زمينه فراتر نرفته است. فاز دوم، exponential phase است و طي آن سيگنال فلئورسنت به طرز قابل توجهي از سيگنال پس‌زمينه بيشتر مي‌شود. در اين شرايط PCR در بهينه‌ترين شرايط ممكن است و محصولات در هر چرخه دو برابر مي‌شوند. فاز سوم Linear phase نام دارد و فاز چهارم نيز، plateau است كه در آن سوبستراها كاهش مي‌يابند و يا تخريب مي‌شوند، آنزيم پليمراز كارايي خود را از دست مي‌دهد و شدت سيگنال فلوئورسنت ديگر افزايش نمي‌يابد.

 

real-time PCR

سه مرحله واكنش Real-time PCR؛ مرحله نمايي در اوايل چرخه سوم شروع مي‌شود، با اين حال دستگاه نمي‌تواند سيگنال‌هاي توليدشده در چرخه‌هاي اول را شناسايي كند. محور x نشانگر تعداد چرخه‌هاي انجام‌شده در آزمايش PCR و محور y نشانگر سيگنال نرماليزه‌شده (Rn) است. Rn برابر نسبت شدت سيگنال رنگ reporter به شدت سيگنال حاصل از رنگ passive reference است. اين رنگ معمولا ROX مي‌باشد و در همه واكنش‌ها حضور دارد.

Real-time PCR وابسته به توانايي دستگاه در تشخيص حداقل تعداد چرخه‌هايي است كه پس از انجام‌شدنشان، ميزان محصولات و درنتيجه سيگنال توليدشده به حدي باشد كه بتواند از noise فلوئورسنت زمينه‌اي دستگاه فراتر رود. اين سيگنال‌ها در محدوده تشخيص دستگاه بوده و در چرخه‌هاي اوليه متغير هستند.

 

شماره چرخه‌اي از PCR كه در آن سيگنال واقعي از noise پس‌زمينه تشخيص داده مي‌شود، cycle threshold و يا CT ناميده مي‌شود. واضح است كه در PCR درصورتي كه شرايط برابر بوده و هيچ‌گونه مهاري وجود نداشته باشد و تجهيزات سالم باشند، هر چه ميزان نوكلئيك‌اسيد اوليه بيشتر باشد، ميزان محصولات و سرعت تشخيص آن‌ها نيز بالاتر خواهد بود. اين موضوع در مورد Real-time PCR نيز صادق است. هرچه ميزان الگوهاي آغازگر بيشتر باشند، سريع‌تر به آستانه خواهيم رسيد و CT نيز كمتر خواهد شد.

 

اين موضوع اساس سنجش مقدار DNA است. در يك واكنش Real-time PCR با بازده 100٪ ميزان محصولات در هر چرخه دو برابر مي‌شود. به طرز مشابهي هر يك عدد تغيير در CT (از CT بيشتر به سمت CT كمتر؛ به عبارت ديگر هر يك عدد كاهش در تعداد چرخه‌هاي موردنياز براي رسيدن به آستانه) نشان‌دهنده دو برابر بودن تعداد مولكول‌هاي هدف در آغاز واكنش است. 2 عدد كاهش نيز نشان‌دهنده 4 برابر بودن تعداد مولكول‌هاي آغازگر است. بر اين اساس مي‌توان رابطه مقابل را نوشت:   Δ CT= 2-ΔCT fold differences

 

مقدار CT به صورت خودكار توسط نرم‌افزار دستگاه Real-time PCR تعيين مي‌شود، اما مي‌تواند به صورت دستي و با تعيين خط آستانه توسط اپراتور انجام گيرد. خط آستانه چه به صورت دستي رسم شود و چه به صورت اتوماتيك، محل برخوردش با منحني تكثير در PCR مشخص‌كننده CT است. CT يا چرخه آستانه‌اي بايد در قسمت نمايي نمودار و جايي كه مواد اوليه واكنش فراوان هستند، باشد.

 

Real-time RT-PCR

در صورتي كه نمونه اوليه در Real-time PCR به جاي DNA، RNA باشد، آزمايش چگونه انجام خواهد گرفت؟ پاسخ در RT-PCR است. نخستين گام در اين فرايند تبديل مولكول‌هاي RNA به مولكول‌هاي DNA تك رشته‌اي مكمل (cDNA) است. پس از انجام اين فرايند مقدماتي، پرايمرهاي PCR و پليمرازهاي Taq به مخلوط اضافه مي‌شوند و واكنش دقيقا مطابق با PCR استاندارد پيش مي‌رود. برخي از DNA پليمرازهاي مقاوم به حرارت داراي توانايي كپي‌برداري از هر دو مولكول DNA و RNA هستند. به اين معني كه داراي هردو نوع فعاليت رونوشت‌برداري معكوس و DNA پليمرازي مستقل از DNA هستند. استفاده از اين آنزيم‌ها امكان انجام اين نوع از PCR را در طي يك واكنش واحد فراهم مي‌كند.real-time PCR

كنترل‌هاي Real-time PCR

واكنش‌هايي كه براي سنجش تفاوت‌هاي ميان ژن‌ها، انواع مختلف سلول‌ها و درمان‌ها استفاده مي شوند، پتانسيل بالايي براي ايجاد نتايج متغير (variability) دارند. اين نتايج مي‌توانند ناشي ازخطا در پيپت‌ كردن مواد واكنش و يا بازده و كارايي متفاوت PCR  يا RT-PCR مورداستفاده باشد؛ و يا اينكه خطا از دستگاهي باشد كه تغييرات شدت نور توليدشده حين Real-time PCR را مي‌سنجد. همچنين ناپايداري (instability) مواد اوليه مورد استفاده در آزمايش نيز مي‌توانند باعث حصول چنين نتايجي شوند. در نتيجه Real-time PCR، نياز به استفاده گسترده از كنترل‌هايي دارد كه به منظور راحتي كار پژوهشگران و متقاعد كردن آنان به درستي نتايج حاصل‌شده طراحي شده‌اند.

 

يك واكنش Real-time PCR عادي چندين كنترل دارد. كنترل بدون الگو يا no-template control (NTC) آزمايشي است كه در آن همه پرايمرها، پروب‌ها و معرف‌هاي لازم براي انجام شدن Real-time PCR وجود دارند، با اين تفاوت كه DNA اوليه الگو نداريم. NTC براي بررسي تشكيل سيگنال و يا عدم تشكيل آن در غياب نوكلئيك‌اسيد هدف است. اين كنترل مي‌تواند آلودگي و هرنوع فعل‌وانفعال پرايمرها و پروب‌ها را كه باعث مخدوش‌شدن نتايج شود، تشخيص دهد.

 

كنترل خارجي (exogenous)، يك نوكلئيك‌اسيد شناخته شده و يا قطعه DNA يا RNA سنتزشده است كه با غلظت معيني در مخلوط واكنش قرار دارد. اين كنترل مي‌تواند به عنوان كنترل مثبت داخلي (Internal Positive Control= IPC) عمل كرده و مهار PCR و يك واكنش منفي حقيقي را از هم تمايز دهد؛ به اين صورت كه قطعه موردنظر را به همراه پرايمر مخصوصش به مخلوط واكنش اضافه مي‌كنيم. اگر شرايط استاندارد باشد و واكنش درست انجام شود، بايد هم اين قطعه و هم توالي هدف Real-time PCR هر دو تكثير شوند. درصورتيكه خود Real-time PCR نتيجه ندهد اما قطعه افزوده‌شده زياد شود، واكنش منفي حقيقي رخ داده است و از علل آن مي‌توان به نبود توالي هدف Real-time PCR اشاره كرد. اگر هر دو قطعه تكثير نشوند، مهار PCR رخ داده است.

 

كنترل داخلي (endogenous control) نوكلئيك‌اسيدي است كه در مخلوط حاوي DNA هدف وجود دارد و درصورت استفاده از پرايمرها و پروب‌هاي مناسب، مي‌‌تواند در آزمايش Real-time PCR شناسايي شود. اين قطعه به عنوان active reference به‌ كار مي‌رود و مي‌تواند به نرماليزه‌ كردن تفاوت‌هايي كه در مقدار كل DNA اوليه‌ اضافه‌شده به آزمايش‌هاي PCR وجود دارد، كمك كند.

 

پركاربردترين كنترل داخلي، استفاده از ژن‌هاي housekeeping است. در بررسي بيان ژن توسط Real-time PCR، اين ژن‌ها بايد همواره وجود داشته و توسط سلول بيان ‌شوند. از جمله اين ژن‌ها مي‌توان به ژن‌هايي اشاره كرد كه براي تداوم بقاي سلول و انجام فرايندهاي حياتي لازم هستند؛ مانند β-actin، GAPDH (glyceraldehyde 3-phospahte dehydrogenase) و 18S RNA. همان‌طور كه گفته شد، اين ژن‌ها بايد در نمونه حاوي DNA هدف وجود داشته‌باشند. بااين‌حال همانندسازي آن‌ها مي‌تواند در چاهك جداگانه‌اي از پليت آزمايش و يا در همان چاهكي كه تكثير توالي هدف صورت مي‌گيرد و از طريق multiplex PCR و استفاده از پروب‌هاي رنگي متفاوت از هم، انجام شود.

 

مقاله مرتبط: تكنيك Multiplex PCR

 

نرماليزه‌ كردن، اصلاح تغييراتي است كه در شدت سيگنال نمونه‌هايي يكسان رخ مي‌دهد و واكنش‌هاي Real-time PCR بايد از لحاظ شدت سيگنال نرماليزه شوند. اين فرايند در دو مرحله بايد صورت بگيرد: اصلاح تفاوت‌ها در غلظت مواد اوليه PCR و نيز جبران تفاوت در مقادير RNA استخراج شده از بافت‌هاي مختلف (در صورت استفاده از Real-time PCR براي بررسي بيان ژن

 

بسياري از آزمايش‌هاي Real-time PCR در پليت‌هاي ميكروتيتر حاوي 384-48 چاهك انجام مي‌گيرد. هركدام از اين چاهك‌ها حاوي نمونه موردنظر و مواد اوليه PCR مي‌باشند. اضافه‌كردن مواد توسط پيپت انجام مي‌گيرد و انجام اين كار به صورت پشت ‌سرهم، باعث ايجاد اختلافاتي در غلظت مواد افزوده‌شده بين چاهك‌هاي مختلف مي‌گردد؛ برخي چاهك ها ممكن است مقادير بيشتر يا كمتري از مواد را دريافت بكنند. اين تفاوت‌ها بين نمونه‌هاي متوالي ممكن است موجب متغير شدن سطوح ژن‌هاي مورد مطالعه شوند و اصلاح آن‌ها با استفاده از passive reference صورت مي‌گيرد. سيگنال ايجادشده هنگام انجام شدن فرايند تكثير، با سيگنال ايجاد شده توسط اين ماده كه معمولا رنگ ROX است، مقايسه مي‌شود. اين ماده از آن جهت passive reference ناميده مي‌شود كه، چون نه به عنوان ماده اوليه در فرايند تكثير شركت كرده و نه باعث مهار آن مي‌شود. اين ماده تنها نوري قرمز رنگ را ايجاد مي‌كند.

 تصور كنيد كه در حال انجام آزمايش Real-time PCR هستيد و به طور تصادفي داخل يكي از چاهك‌هاي پليت، 200ng از mRNAهاي استخراج‌ شده از سلول‌هاي كبدي و داخل ديگري 100ng از كل mRNAهاي استخراج شده از سلول‌هاي عضلاني را مي‌ريزيد. حتي اگر ژن هدف در هر دو نوع از سلول‌ها در سطوح يكساني بيان شود، در نهايت در نتيجه آزمايش به نظر خواهد رسيد كه ژن در سلول‌هاي كبدي دو برابر سلول‌هاي عضلاني بيان شده است. نرماليزه كردن، كه با تقسيم شدت سيگنال رنگ reference (رنگ آزاد شده حين انجام فرايند تكثير) به شدت سيگنال رنگ passive reference انجام مي‌گيرد، مي‌تواند اين خطاها را اصلاح كند. اين تقسيم موجب ايجاد كميتي به نام Rn  مي‌گردد.

 

 كاربرد Real-time PCR

Real-time PCR در آزمايشگاه‌هاي تشخيصي ميكروبيولوژي بسيار محبوب است و انواع مختلفي از تجهيزات و كيت‌هاي تجاري به منظور تشخيص سريع عفونت‌هاي ويروسي مختلف توسعه يافته‌اند. PCR غالبا براي تعيين مقدار DNA در نمونه موردنظر به كار مي‌رود. اين موضوع در بررسي پيشرفت عفونت‌هاي ويروسي با اندازه‌گيري ميزان پاتوژن‌ها كمك‌‌كننده است.

 

PCR براي تعيين حضور توالي DNA يك ميكروارگانيسم مشخص نيز مورد استفاده قرار مي‌گيرد؛ پيش از آن‌كه نتيجه تست‌هاي سرولوژيك و يا كشت مشخص شود. آزمايش‌هاي Real-time PCR امكان حصول هر چه سريع‌تر به نتايج را فراهم مي‌كنند. برخي از نتايج حتي در مدت زماني كمتر از يك ساعت پس از نمونه‌برداري حاضر مي‌شوند. اين موضوع خصوصا در مبارزه عليه استافيلوكوكوس اورئوس مقاوم به متي‌سيلين (MRSA)، اهميت دارد؛ به اين صورت كه بيماران مي‌توانند به سرعت هنگام بستري شدن از لحاظ اين باكتري تست شوند. افرادي كه MRSA مثبت هستند، مي‌توانند قرنطينه شوند تا خطر ايجاد عفونت در ساير بيماران خصوصا آن‌هايي كه در معرض خطر هستند، به حداقل برسد.

 

تكينك Real-time RT-PCR اخيرا بيش از پيش به عنوان وسيله‌اي براي سنجش ميزان RNA مورد استفاده قرار مي‌گيرد. از جمله كاربردهاي اين روش، تعيين ميزان بيان يك ژن مشخص با اندازه‌گيري ميزان mRNAهاست. ژن موردمطالعه مي‌تواند ژني باشد كه در يك سلول سرطاني روشن‌ شده است. در اين حالت، سنجش ميزان mRNAهاي حاصل از آن، امكان بررسي پيشرفت سرطان و تاثير درمان‌هاي صورت گرفته را فراهم مي‌كند.

 تكينك Real-time RT-PCR اخيرا بيش از پيش به عنوان وسيله‌اي براي سنجش ميزان RNA مورد استفاده قرار مي‌گيرد. از جمله كاربردهاي اين روش، تعيين ميزان بيان يك ژن مشخص با اندازه‌گيري ميزان mRNAهاست. ژن موردمطالعه مي‌تواند ژني باشد كه در يك سلول سرطاني روشن‌ شده است. در اين حالت، سنجش ميزان mRNAهاي حاصل از آن، امكان بررسي پيشرفت سرطان و تاثير درمان‌هاي صورت گرفته را فراهم مي‌كند.

 حساسيت فوق‌العاده PCR تضمين‌كننده اين موضوع است كه بيماري باقي مانده حداقل (minimal residual disease= MRD) مي‌تواند پس از درمان اختلال شناسايي شود.  تشخيص سريع عود بيماري در انتخاب روش مناسب درماني كمك كننده است. به عنوان مثال Real-time PCR مي‌تواند در تشخيص لوسمي‌ها و لنفوم‌ها از روي translocationهايي مانند t(9;22) كه مشخصه لوسمي مزمن ميلوئيدي (CML) است، سودمند باشد.

 توانايي اندازه‌گيري دقيق ميزان بيان ژن‌ها در درك نحوه بيمار شدن سلول‌ها و پيش‌بيني پاسخ آن‌ها به درمان حياتي است. چه تغييراتي در رونويسي مي‌توانند باعث سرطاني شدن سلول‌ها شوند؟ در پاسخ به درمان و يا در مواجهه با يك عفونت ويروسي كدام ژ‌ن‌ها روشن و كدام‌ها خاموش مي‌شوند؟

 البته سنجش ميزان بيان ژن توسط Real-time PCR نتايجي نسبي به دست مي‌دهد؛ به آن معني كه مقدار دقيق mRNAهاي ساخته‌شده از يك ژن را اندازه‌گيري نمي‌كند. در اين روش ما تنها مقدار رونوشت‌هاي توليدشده را با برخي ديگر از ژن‌ها مقايسه مي‌كنيم. اين تفاوت به صورت fold differences (اين كه چند برابر است) بيان مي شود. اين مقايسه نسبي به عنوان مثال مي‌تواند براي تعيين تفاوت‌ در بيان ژن‌هاي heat shock در سلول‌هاي سرطاني در مقايسه با سلول‌هاي سالم انجام بگيرد. از ديگر كاربردها، مقايسه بيان يك ژن در يك بافت با بيان آن در بافتي ديگر، خصوصا زماني كه درمان به خصوصي انجام گرفته است، مي‌باشد. ژني كه پاسخ آن سنجيده مي‌شود، هدف و ژني كه با آن مقايسه مي‌كنيم، calibrator نام دارد و معمولا نشان‌دهنده كنترلي است كه روي آن درماني صورت نگرفته است.

 

 

تاریخ به روز رسانی:
1398/05/17
تعداد بازدید:
47
امتیازدهی
میانگین امتیازها:0 تعداد کل امتیازها:0
مشاهده نظرات (تعداد نظرات 0)

ارسال نظرات
نام
آدرس پست الکترونیکی شما
شماره تلفن
توضیحات
تغییر کد امنیتی
کد امنیت
يزد، صفاييه ، خيابان بوعلي ،پژوهشكده علوم توليد مثل يزد
(258) 38247085 - 035
Powered by DorsaPortal