دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد
PCR

PCR چيست؟

PCR يا واكنش زنجيره اي پليمراز به‌منظور ساخت ميليون‌ها كپي از قطعه DNA موردنظر، به‌كارمي‌رود. PCR يا واكنش زنجيره اي پليمراز (Polymerase Chain Reaction) در زيست‌شناسي مولكولي به ‌منظور ساخت ميليون‌ها كپي از قطعه DNA موردنظر، به‌كارمي‌رود. اين تكنيك براي نخستين بار در سال 1983 توسط Kary Mullis، شيمي‌دان آمريكايي، ابداع شد. وي به مناسبت اين دستاورد مهم در سال 1993 برنده جايزه نوبل گرديد. PCR امكان توليد ميليون‌ها نسخه از يك قطعه مشخص موجود در مقادير اندك DNA را فراهم مي‌كند.

مدت زمان كوتاهي پس از اختراع PCR توسط موليس، اين تكنيك انقلابي را در بيولوژي مولكولي پديد آورد و باعث افزايشي ناگهاني در سرعت پيشرفت مطالعات ژنومي شد. امروزه با استفاده از PCR قادر به استخراج هر ژني از هر ارگانيسمي هستيم. سرعت، حساسيت بسيار بالا و robustness تكنيك PCR، آن را به تكنيكي معمول در تحقيقات آزمايشگاهي پزشكي و زيست‌شناسي كه به اين سه مشخصه نياز دارند، تبديل كرده است.

 

عدم نياز به باكتري‌ها براي تكثير، PCR را به روشي سريع و آسان تبديل كرده‌است؛ خصوصا اگر توالي كامل ژنوم ارگانيسم مشخص باشد. اين روش تكنيكي معمول در تحقيقات آزمايشگاهي پزشكي و زيست‌شناسي است و از آن در پردازش DNA براي توالي‌يابي، تعيين وجود يا عدم وجود يك ژن خاص به منظور تشخيص عامل عفونت و تهيه پروفايل DNA در تحقيقات جنايي استفاده مي‌شود. حساسيت PCR بسيار بالاست؛ به‌طوري‌كه مي‌تواند مقدار كم DNA موجود در قطره خون به‌جامانده در صحنه جرم، و يا نسخه‌هاي اندكي از ژنوم ويروسي موجود در خون بيمار را تشخيص دهد.

اساس واكنش PCR چيست و چگونه انجام مي‌گيرد؟

تكنيك PCR با بهره‌گيري از اصول اوليه فرايند طبيعي سنتز DNA و همانندسازي، مولكول‌هاي DNA را در داخل لوله آزمايش كپي مي‌كند. در داخل سلول‌هاي زنده، سيستمي پيچيده كه متشكل از تعداد فراواني پروتئين است، همانندسازي ژنوم را انجام مي‌دهد: دو رشته DNA از هم باز مي‌شوند و هر رشته مولكول مادر به عنوان الگويي براي توليد رشته‌هاي مكمل دختر مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اساس اين نسخه برداري، همان قانون معروف واتسون و كريك است: A همواره با T و G همواره با C جفت مي‌شود. PCR مشابه يك دستگاه فتوكپي است و همانند اين دستگاه كه نياز به موادي مثل كاغذ، جوهر و سخت‌افزار دارد، PCR نيز نيازمند مواد اوليه خاصي است. پنج جزء اصلي براي انجام PCR مورد نياز است كه در ادامه به نقش دقيق هر كدام از آن‌ها بيشتر خواهيم پرداخت:

نمونه DNA‌اي كه قرار است از آن كپي تهيه شود.

رشته‌هاي كوتاهي از DNA به نام پرايمرها، كه آغازگر واكنش PCR هستند. پرايمرها به‌گونه‌اي طراحي مي‌شوند كه بتوانند از سمت 3 پريم هر دو رشته به توالي موردنظر متصل شوند؛ از اين رو به دو نوع پرايمر نياز خواهيم داشت.

نوكلئوتيدها (dNTPها) كه واحدهاي ساختماني DNA بوده و براي ساخت رشته جديد مورد نياز مي‌باشند.

آتزيم Taq پليمراز كه بازهاي جديد را به ساختار DNA مي‌افزايد.

بافر كه شرايط مناسب انجام آزمايش PCR را فراهم مي‌كند.

در PCR گرم كردن و سرد كردن به‌صورت پشت سر هم و توسط دستگاه انجام مي‌گيرد. اين فرايند چرخه حرارتي نام دارد.

آزمايش PCR سه مرحله اصلي دارد:

دناتوراسيون (Denaturation): DNA دورشته‌اي حرارت داده مي‌شود تا به دو DNA تك‌رشته‌اي تبديل شود.

اتصال (Annealing): دما به ميزاني پايين آورده مي‌شود تا پرايمرها بتوانند به رشته الگو متصل شوند.

گسترش (Extending): با افزايش دما، رشته جديد توسط آنزيم Taq پليمراز شروع به ساخته‌شدن مي‌كند.

اين سه مرحله، 20 الي 40 بار تكرار مي‌شوند و در هر مرتبه تعداد كپي‌هاي تهيه شده از هر DNA دو برابر مي‌شود.

يك آزمايش PCR مي‌تواند در كمتر از يك ساعت به طور كامل به انجام برسد. البته مدت زمان انجام آن به سرعت دستگاه‌ها نيز بستگي دارد.

پس از انجام شدن PCR، از تكنيك الكتروفورز براي بررسي تعداد قطعات توليد شده و اندازه آن‌ها استفاده مي‌شود.

مراحل اصلي PCR

pcr - Molecular Biology of the Cell

هر چرخه PCR شامل سه مرحله است. 1- DNA دو رشته‌اي حرارت داده مي‌شود تا دو رشته آن از هم جدا شوند. 2- DNA در معرض تعداد فراواني از دو نوع پرايمر مشخص قرار مي‌گيرد تا حدود بخش موردنظر از DNA مشخص شود. نمونه بايد سرد شود تا پرايمرها بتوانند به توالي مكمل خود متصل شوند. 3- سپس مخلوط با DNA پليمراز و 4 نوع دئوكسي ريبونوكلئوتيد تري ‌فسفات انكوبه مي‌شود تا DNA از محل پرايمرها شروع به سنتز كند.

مرحله دناتوراسيون

طي اين مرحله تمام پنج جزء اصلي نام‌برده‌شده از جمله DNA الگو تا دماي 95-94 درجه سانتيگراد حرارت داده‌مي‌شوند.

دماي بالا باعث از هم گسستن پيوندهاي هيدروژني بين بازها شده و دو رشته DNA جداگانه حاصل مي‌گردد.

اين دو رشته به‌عنوان الگويي براي ساخت رشته‌هاي جديد DNA عمل مي‌كنند.

مدت زمان افزايش دما تا اين حد بايد به ميزاني باشد كه تمام مولكول‌هاي DNA دو رشته‌اي شوند.

اين فرايند معمولا 30-15 ثانيه طول مي‌كشد.

مرحله اتصال

در اين مرحله، دما تا حدود 65-50 درجه سانيگراد پايين مي‌آيد. درنتيجه پرايمرها با پيوند هيدروژني به نقاط اتصال مخصوص به خود در DNA تك رشته‌اي متصل مي‌شوند. البته دماي دقيق به نقطه ذوب پرايمر مورد استفاده بستگي دارد.

پرايمرها توالي‌هاي تك‌رشته‌اي DNA يا RNA هستند كه طولي به اندازه 30-20 باز دارند و انتهاي 3 پريم مورد نياز براي آغاز فعاليت پليمراز و سنتز DNA را تهيه مي‌كنند.

پرايمرها توسط آزمايش‌گر به گونه‌اي طراحي و ساخته مي‌شوند كه توالي‌شان مكمل دو انتهاي 3 پريم توالي DNA موردنظر باشد. پرايمرها اين توانايي را دارند كه نقطه شروع قطعه را در هر دو رشته از ژنوم مكان‌يابي كنند.

پرايمرها به عنوان تعيين كننده نقطه شروع سنتز DNA جديد عمل مي‌كنند؛ چون آنزيم DNA پليمراز تنها مي‌تواند بازهاي جديد را به DNA دو رشته‌اي بيافزايد. پس از اتصال پرايمر است كه پليمراز نيز متصل شده و ساخت رشته مكمل را آغاز مي‌كند.

دو رشته جدا شده DNA مكمل هم بوده ولي در دو جهت متفاوت قرار دارند (منظور از جهت نحوه قرارگيري انتهاهاي 3 پريم و 5 پريم است). در نتيجه 2 نوع پرايمر خواهيم داشت: Forward Primer و Reverse primer. به بيان ديگر، دو پرايمر به دو انتهاي 5 پريم موجود متصل مي‌شود.

اين مرحله 30-10 ثانيه زمان مي‌برد.

مرحله گسترش

طي اين مرحله، دما تا 72 درجه سانتيگراد افزايش داده مي‌شود. درنتيجه آنزيم Taq DNA پليمراز فعال شده و افزودن بازهاي آلي و سنتز رشته جديد را از سمت 5 پريم به 3 پريم شروع مي‌كند.

Taq DNA پليمراز آنزيمي است كه از نوعي باكتري گرمادوست به نام Thermus aquaticus گرفته‌شده‌است.

محيط زندگي اين باكتري غالبا چشمه‌هاي آب گرم است و در نتيجه مي‌تواند حرارت بالاي 80 درجه سانتيگراد را تحمل كند.

DNA پليمراز باكتري، در دماهاي بالا پايدار است. اين به آن معني است كه مي‌تواند دماي بالايي را كه براي جدا كردن دو رشته DNA از همديگر در مرحله دناتوراسيون مورد نياز است، تحمل كند. در نتيجه افزودن آنزيم پس از هر بار انجام شدن چرخه، مورد نياز نخواهد بود.

DNA پليمراز بسياري از ارگانيسم‌ها قادر به تحمل اين دما نيست. به عنوان مثال، دماي مناسب براي فعاليت پليمراز انساني 37 درجه سانتيگراد است.

دماي بهينه آنزيم Taq DNA پليمراز 72 درجه است. اين آنزيم به پرايمر متصل شده و نوكلئوتيدها را به DNA تك رشته‌اي مي‌افزايد.

مدت زمان اين مرحله بستگي به طول توالي موردنظر دارد. كپي شدن هزار باز DNA حدود يك دقيقه زمان مي‌برد.

pcr - Molecular Biology of the Cell

با تكرار چرخه توضيح داده شده در شكل پيشين، قطعات جديد در چرخه‌هاي بعدي به عنوان الگو عمل مي‌كنند. از آن‌جا كه پليمرازها و پرايمرها در مخلوط باقي مي‌مانند، تنها كاري كه بايد انجام شود، گرم‌كردن و سردكردن پي‌در‌پي مخلوط است. هر چرخه مقدار DNA سنتز شده در چرخه‌هاي پيشين را دو برابر مي‌كند؛ از اين رو پس از چند چرخه، DNA غالب، نسخه‌هاي جديد توليدشده از توالي موردنظر است. به عنوان مثال، مطابق شكل از 3 چرخه انجام شده درمجموع 16 عدد DNA توليد شده كه 8تاي آن‌ها از لحاظ توالي منطبق بر يكي از دو رشته توالي دلخواه هستند. پس از سپري شدن 4 چرخه ديگر، 240 قطعه از كل 256 قطعه توليدشده، منطبق بر توالي موردنظر خواهند بود. معمولا پس از انجام 20-30 چرخه، كلون ناحيه موردنظر به شكل موثري انجام گرفته و غلظت بقيه ژنوم در مقايسه با ناحيه كلون‌شده، قابل چشم‌پوشي مي‌شود.

چرخه حرارتي كه شامل اين سه مرحله است، 20 تا 40 مرتبه تكرار مي‌شود و هر چرخه نيز حدود 5 دقيقه به طول مي‌انجامد تا كپي‌هاي فراواني از قطعه DNA دلخواه‌مان تهيه شود.

قطعات DNA جديدي كه حين PCR توليد مي‌شوند نيز به عنوان الگو عمل كرده و Taq DNA پليمراز به اين قطعات متصل شده و رشته جديد را توليد مي‌كند.

نتيجه توليد ميليون‌ها كپي از بخش خاصي از DNA در مدت زماني بسيار كوتاه است.

PCR بهترين روش موجود براي كلون كردن قطعات نسبتا كوتاه DNA (كمتر از 10000 جفت نوكلئوتيد) است. قطعات RNA نيز مي‌توانند با اين روش كپي شوند اما ابتدا بايد تحت تاثير آنزيم رونوشت بردار معكوس (Reverse Transcriptase) به صورت DNA دربيايند.

حساسيت PCR  بسيار بالاست و مي‌تواند عوامل بيماري‌زا را حتي در مراحل اوليه عفونت تشخيص دهد. در اين گونه موارد،‌ توالي‌هاي كوتاهي كه مكمل ژنوم عامل بيماري‌زا هستند، ساخته و به عنوان پرايمر مورد استفاده قرار مي‌گيرند. پس از انجام چرخه‌هاي متعدد، حتي نسخه‌هاي اندك ژنوم باكتريايي يا ويروسي قابل تشخيص هستند.

پرايمرها

PCR نيازمند سنتز يك سري توالي‌هاي اليگونوكلئوتيدي است كه در سنتز DNA جديد به صورت انتخابي، به عنوان پرايمر عمل مي‌كنند. پرايمرها در موفقيت PCR و يا شكست آن نقشي كليدي دارند. در صورت طراحي صحيح پرايمرها، آزمايش منجر به تكثير يك قطعه DNA واحد مي‌گردد كه منطبق بر ناحيه هدف در مولكول الگو است. در صورت طراحي نادرست، واكنش با شكست روبه‌رو خواهد شد.

تعيين توالي مناسب براي پرايمر كار دشواري نيست: پرايمرها، اختصاصي دو توالي بلافاصله مجاور ناحيه هدف بوده و طولي در حدود 18 تا 25 نوكلئوتيد دارند. براي اينكه هيبريداسيون بتواند اتفاق بيفتد، هر پرايمر بايد از لحاظ توالي مكمل رشته هدف باشد. همچنين انتهاي 3’ دو پرايمر مورد استفاده بايد به سمت يكديگر قرار بگيرند.

سنتز پرايمر‌ها از روي توالي‌هاي هدف معيني صورت مي‌گيرد، پس به اين منظور بايد اطلاعاتي در مورد اين توالي‌ها داشته باشيم. در حالت ايده‌آل، قطعات DNA موردنظر نيز نبايد طولي بيش از 3 كيلوباز و كمتر از يك كيلوباز داشته باشند. البته قطعاتي با طول بيش از 10 كيلوباز نيز مي‌توانند با تكنيك‌هاي PCR استاندارد تكثير شوند، اما اين نكته را نيز بايد مدنظر داشت كه با افزايش طول قطعات، بازده فرايند تكثير كاهش خواهد يافت.

آزمايش PCR - پرايمرها

تصوير 4 . جفت‌پرايمرهايي كه به منظور تكثير ژن α-گلوبين انساني طراحي شده‌اند.

طول پرايمرها از جمله مهم‌ترين پارامترها در سنتز پرايمر است. در صورتيكه پرايمرها كوتاه‌تر از حد باشند، ممكن است به نقاط غيراختصاصي متصل شده و محصولات غيراختصاصي توليد كنند. به عنوان مثال، در صورتيكه در يك آزمايش PCR، براي DNA توتال انساني از پرايمري 8 نوكلئوتيدي استفاده شود، به احتمال زياد، قطعات مختلفي تكثير خواهند شد.

حال سوال اين است كه چرا پرايمرهاي طولاني‌تري ساخته نمي شوند؟ طول پرايمر سرعت هيبريداسيون آن با DNA هدف را تحت تاثير قرار مي‌دهد و پرايمرهاي كوتاه‌تر با سرعت كمتري هيبريد مي‌گردند. درنتيجه كارايي PCR كه بر اساس تعداد قطعات تكثيرشده در حين آزمايش تعيين مي‌گردد، كاهش خواهد يافت. علت اين موضوع ، افزايش طول پرايمرها و عدم هيبريداسيون كامل آن‌ها با توالي الگو در مدت زمان تعيين شده در چرخه مي‌باشد. پرايمرهاي با طول بيش از 30 نوكلئوتيد ندرتا مورد استفاده قرار مي‌گيرند.

در بسياري از واكنش‌ها هدف تكثير يك توالي DNA واحد است؛ در اين موارد، از اهداف مهم، كاهش احتمال اتصال پرايمر به نقاطي غير از نقطه موردنظر است. پس نبايد از توالي‌هاي تكراري استفاده نمود. به منظور حصول اطمينان از مكمل نبودن بازهاي داخل يك پرايمر با يكديگر، توالي پرايمر نبايد محتوي تكرارهاي معكوس (inverted repeats) و يا هر گونه توالي‌ self-complementary با طولي بيش از 3 جفت‌باز باشد. به منظور جلوگيري از اتصال دو پرايمر به يكديگر و تشكيل دايمر پرايمر، توالي 3’ هيچ يك از پرايمرها نبايد در هيچ كدام از جايگاه‌ها مكمل خود و يا پرايمر دوم باشد.

دايمرهاي پرايمر، محصول گسترش پرايمر از روي خود و يا پرايمري ديگر هستند. از آن‌جايي كه اين محصولات حاوي توالي يكي از پرايمرها‌ و يا هر دوي آن‌ها و نيز توالي مكمل اين پرايمرها هستند، الگوي مناسبي براي واكنش‌هاي تكثير بعدي فراهم مي‌كنند. نسخه‌برداري آسان‌تر مولكول‌هاي كوچكتر باعث بدتر شدن شرايط نيز مي‌شود. دايمرهاي پرايمر مي‌توانند در واكنش PCR غالب شده و پرايمر ار از توالي هدف حقيقي خود جدا نمايند.

تاریخ به روز رسانی:
1398/05/17
تعداد بازدید:
39
امتیازدهی
میانگین امتیازها:0 تعداد کل امتیازها:0
مشاهده نظرات (تعداد نظرات 0)

ارسال نظرات
نام
آدرس پست الکترونیکی شما
شماره تلفن
توضیحات
تغییر کد امنیتی
کد امنیت
يزد، صفاييه ، خيابان بوعلي ،پژوهشكده علوم توليد مثل يزد
(258) 38247085 - 035
Powered by DorsaPortal