دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد
مولكولار سايتو ژنتيك (FISH)

روش FISH چيست؟

اساس تكنيك FISH، توانايي قطعه‌اي از مولكول تك‌رشته‌اي DNA در اتصال به توالي مكمل خود روي كروموزوم متافازي، هسته اينترفازي و يا extended chromatin fiber است. پس نياز به فرايندهاي پردازشي ويژه‌اي خواهد بود. اين مولكول، پروب نام دارد و بخش كوچكي از DNA مي‌باشد كه با تگ‌هاي فلورسنت ليبل شده است. فلوروكروم‌ها امكان تشخيص ناحيه‌ هيبريداسيون را با استفاده از ميكروسكوپ‌هاي فلورسنت فراهم مي‌كنند.

تكنيك‌هايي كه پيش‌تر به آن‌ها پرداختيم، وابسته به هيبريداسيون مولكول‌هاي DNA و يا RNA خالص‌شده‌اي هستند كه در ژل آگارز قرار دارند. در تكينك FISH يا  Fluorescent in situ hybridization، مولكول‌هاي پروب مستقيما با مولكول‌هاي DNA و RNA داخل سلولي هيبريد مي‌شوند و موقعيت اتصال قطعه DNA به كروموزوم را مي‌توان به سادگي توسط ميكروسكوپ تعيين كرد. در واقع اين تكنيك‌، حاصل تركيب سيتوژنتيك با تكنولوژي‌هاي ژنتيك مولكولي است و از اواسط دهه 1990، به صورت گسترده‌اي به منظور تشخيص كلينيكي به كار مي‌رود.

سلول‌هاي هدف مي توانند از قطعات بسيار كوچك بافتي از ارگانيسمي مشخص تهيه شوند. همانند زماني كه بيوپسي تهيه مي شود، بافت موردنظر فيكس و سپس به قطعات بسيار كوچك تقسيم مي‌گردد تا بتوان آن را زير ميكروسكوپ آناليز نمود. منبع ديگري كه براي تهيه سلو‌ل‌ها استفاده مي‌شود، سلول‌هاي كشت‌شده هستند. به علاوه مي‌توان از خون استفاده و طي پردازش‌هاي ويژه‌اي گلبول‌هاي سفيد و سپس كروموزوم‌هاي موجود در آن‌ها را استخراج نمود.

در تكنيك FISH كروموزومي عادي، كروموزوم‌هاي مورد استفاده در مرحله متافاز يا پرومتافاز و به صورت پراكنده و فيكس وي اسلايد شيشه‌اي هستند و با پروب‌هاي DNA هوموژن هيبريد خواهند شد. هيبريداسيون پروب، غالبا به صورت دو نقطه در DNA مورد بررسي مشاهده مي‌شود؛ چون پروب ليبل‌شده به هر دو كروماتيد خواهري متصل خواهد شد. حداكثر رزلوشن FISH متافازي در حد چندين مگاباز است كه با استفاده از fiber FISH مي‌توان آن را در حد كيلوباز افزايش داد.

 

 

تكنيك FISH؛ هيبريداسيون in situ به منظور تعيين موقعيت ژن‌ها در كروموزوم‌هاي استخراج‌شده به كار مي‌رود. در اينجا از 6 پروب DNA متفاوت براي علامت‌گذاري توالي مكملشان در كروموزوم شماره 5 انساني، هم نسخه پدري و هم نسه مادري، استفاده شده‌ و اين كروموزوم‌ها متعلق به مرحله متافاز سلولي در حال ميتوز مي‌باشند. هر كدام از اين پروب‌ها با مواد مختلفي نشانه‌گذاري و براي شناسايي آن‌ها از آنتي‌بادي‌هاي فلوئوروسنت اختصاصي آن مواد استفاده شده ‌است. ابتدا كروموزوم‌ها دناتوره مي‌شود تا پروب ها بتوانند با توالي مكملشان جفت شوند. از آن‌جايي كه سلول در حال ميتوز بوده و DNA آن همانندسازي‌شده است، هر كدام از پروب بر روي كروموزوم‌ها دو نقطه ايجاد كرده اند. تكنيك FISH | پروب | Fluorescent in situ hybridization | سيتوژنتيك | فلوروكروم‌ | ميكروسكوپ‌هاي فلورسنت | پروب‌هاي سنترومريك | تشخيص سندروم‌هاي آنوپلوئيدي | بيوتكنولوژي | ژنتيك | زيست | بيوتك | استخدامي بيوتكنولوژي | مهندسي ژنتيك | داروسازي | كنكور | آزمايشگاه | استخدامي | نانو | نانوتكنولوژي |سعيد كارگر | تلگرام | بيوانفورماتيك | ميكروبيولوژي | زيست فناوري | تراريخته | آزمايشگاه | كنگره | همايش |genetic | استخدامي | كريسپر | crispr | biotechnology | microbiology | biology | biochemestry | molecularbiology | nanobiotechnology | microbiology

 

تكنيك FISH اينترفازي نيز به علت فشردگي كمتر كروموزوم‌ها در اين مرحله، رزلوشن بالايي دارد. در اين حالت، مولكول‌هاي پروب با DNA هاي كروموزومي هدف كه داخل سلول‌ها و يا هسته‌هاي آماده‌سازي شده هستند، هيبريد مي‌شوند. اين هسته‌ها يا سلول‌ها بايد تحت تاثير آنزيم ها هضم شوند تا پروب بتواند به آن‌ها دسترسي پيدا كند. تكنيك FISH اينترفازي مي‌تواند روي نمونه‌هاي تازه و فريزشده و يا روي موادي كه در پارافين فيكس شده اند، انجام بگيرد.

 

پروب‌هاي مورداستفاده در FISH انواع مختلفي دارند. پروب‌هاي سنترومريك مخصوص توالي‌هاي DNA تكراري هستند كه در اطراف سنترومر كروموزوم موردنظر و يا در داخل آن قرار گرفته‌اند. در واقع اين پروب‌ها بودند كه در ابتدا به منظور تشخيص سندروم‌هاي آنوپلوئيدي شايع (تريزومي‌هاي 13 و 18 و 21) از نمونه پرزهاي كوريوني استفاده مي شدند.پروب‌هايChromosome-Specific Unique-Sequence Probe اختصاصي يك لوكوس ژني مشخص مي‌باشند و كاربرد آن‌ها در تشخيص جهش‌هاي حذف يا مضاعف شدن submicroscopic است. پروب‌هاي Whole-Chromosome Paint شامل دسته‌اي از پروب‌ها هستند كه از نواحي مختلفي از يك كروموزوم مشخص تهيه شده اند. در صورت استفاده از تركيب اين پروب‌ها در يك فرايند هيبريداسيون، كل كروموزوم فلورسنس نشر خواهد كرد. كاربرد اين پروب‌ها در تشخيص rearrangement هاي پيچيده مانند جابه‌جايي‌هاي جزئي و نيز تشخيص SMC ها است.

 

ليبل كردن پروب‌ها مي‌تواند به صورت مستقيم با الحاق پيش‌سازهاي نوكلئوتيدي ليبل‌شده با مواد فلورسنت به ساختار پروب صورت بگيرد. همچنين نوكلئوتيد‌هاي حاوي مولكول‌هاي reporter مانند بيوتين و ديگوكسي‌ژنين وارد ساختار DNA مي‌گردند كه خواهند توانست به صورت اختصاصي به مولكول‌هاي affinity كه با مواد فلورسنت ليبل شده اند، متصل شوند. با استفاده از تجهيزات پيشرفته پردازش تصوير و مولكول‌هاي متصل‌شونده به reporter كه داراي رنگ‌هاي فلورسنت متفاوتي هستند، مي‌توان چندين پروب DNA را به صورت همزمان با DNA هدف هيبريد كرد، به نحوي كه موقعيت چندين توالي خاص در ارتباط با يكديگر شناسايي شود.

 

مولكول‌هاي DNA صرف نظر از منبع مورد استفاده، بايد حرارت داده شوند تا تبديل به مولكول‌هاي تك‌رشته‌اي گردند. در صورتي كه مولكول‌هاي هدف از جنس RNA باشند نيازي به حرارت دادن نخواهد بود.در مرحله بعدي محلول حاوي پروب‌ها ليبل‌شده به نمونه فيكس‌شده، افزوده و نتايج زير ميكروسكوپ بررسي مي‌شوند. ليبل‌هاي مورد استفاده در پروب‌ها، مانند مواد فلوئوروسنت، باعث مي‌شوند كه در صورت وجود توالي هدف و انجام شدن هيبريداسيون با توالي‌هاي مكمل، تغييرات قابل مشاهده‌اي در نمونه از جمله نشر نور با طول موج معين، ايجاد شود. در نتيجه موقعيت پروب روي كروموزوم قابل مشاهده مي‌گردد.

تاریخ به روز رسانی:
1398/05/17
تعداد بازدید:
41
امتیازدهی
میانگین امتیازها:0 تعداد کل امتیازها:0
مشاهده نظرات (تعداد نظرات 0)

ارسال نظرات
نام
آدرس پست الکترونیکی شما
شماره تلفن
توضیحات
تغییر کد امنیتی
کد امنیت
يزد، صفاييه ، خيابان بوعلي ،پژوهشكده علوم توليد مثل يزد
(258) 38247085 - 035
Powered by DorsaPortal